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細(xì)胞培養(yǎng)與顯微鏡

更新時(shí)間:2021-02-22點(diǎn)擊次數(shù):1750

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以根據(jù)幾種不同的特征進(jìn)行細(xì)分。上一期我們介紹了其顯著的分類特征——形態(tài),而另一個(gè)區(qū)別就是細(xì)胞類型。根據(jù)其來源,細(xì)胞可以細(xì)分為永生化細(xì)胞,原代細(xì)胞和干細(xì)胞(包括患者特異性細(xì)胞)。

 

細(xì)胞類型

永生化細(xì)胞

使用中常見的細(xì)胞類型可以追溯到永生化細(xì)胞,這些細(xì)胞要么來源于腫瘤組織,要么已被癌基因轉(zhuǎn)染。由于其惡性背景,它們會(huì)無限分裂。這以特性使它們非常適合作為細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng),而且功能強(qiáng)大且價(jià)格適中。其他常用的永生化細(xì)胞系是HEK,A549,Jurkat,MDCK,COSVero細(xì)胞。

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原代細(xì)胞

原代細(xì)胞直接取自活體組織。為了培養(yǎng),將原始組織片段通過酶、化學(xué)或機(jī)械方法解離為單個(gè)細(xì)胞,然后將其接種到培養(yǎng)瓶中。原代細(xì)胞比永生細(xì)胞系更難培養(yǎng),他們的生存率很低,而且許多沒有分裂。此外,它們的基因操作可能具有挑戰(zhàn)性。盡管如此,還是值得付出努力的,因?yàn)樗鼈兊奶匦愿咏匀患?xì)胞。換句話說,用原代細(xì)胞獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以更有信心地轉(zhuǎn)化到體內(nèi)。

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干細(xì)胞

干細(xì)胞是人體的原始細(xì)胞。它們可以從非專能細(xì)胞分化為具有特征和功能的組織細(xì)胞。因此,它們可以分為幾類。多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells)是用途廣泛的干細(xì)胞,能夠分化為任何種類的人體細(xì)胞。與多能干細(xì)胞相比,專能干細(xì)胞(multipotent stem cells)顯示出有限的分化范圍。雙能干細(xì)胞只能發(fā)育成兩種不同的細(xì)胞類型。干細(xì)胞除了分化成特殊的細(xì)胞類型外,還可以自我更新。

 

 

細(xì)胞培養(yǎng)模式

上面提到的所有細(xì)胞類型都擁有不同的生長方式。例如,一次細(xì)胞培養(yǎng)可以僅由單個(gè)細(xì)胞類型或多種細(xì)胞類型組成,并且可以進(jìn)行2D或3D培養(yǎng)。

 

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另一方面,2D單培養(yǎng)也是維持細(xì)胞生長人工的方式,主要原因有兩個(gè):細(xì)胞在生物體中呈3D生長,而且它們并不會(huì)與其他類型細(xì)胞分開生長。

 

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想要進(jìn)入3D世界,細(xì)胞生物學(xué)家必須運(yùn)用某些技巧。其中之一是消除細(xì)胞粘附在培養(yǎng)基上的機(jī)會(huì),可以通過使用帶有特殊涂層的細(xì)胞培養(yǎng)容器、使用凝膠培養(yǎng)基(例如Matrigel™),或通過懸滴培養(yǎng)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。這種物體更接近更真實(shí)組織,包括天然組織中常見的代謝和增殖梯度。這也是球狀體通常被用于藥物開發(fā)的原因之一,因?yàn)樗鼈兡M了血管腫瘤。

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在更逼真的3D細(xì)胞培養(yǎng)的另一種方法是使用支架??梢岳糜山饘?,聚合物或陶瓷制成的培養(yǎng)基來幫助細(xì)胞蠕變成三維形。這些支架可以用作臨床植入,也可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室。

 

另一個(gè)非常真實(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)組織是基于在細(xì)胞外基質(zhì)凝膠內(nèi)部存在不同生長因子的情況下培養(yǎng)的干細(xì)胞。根據(jù)生長因子的類型(eg:FGF,EGF等)和其他組分,干細(xì)胞會(huì)發(fā)育成稱為類器官的微型器官。

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生長條件

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)必須保持在37°C,通常在具有各種形狀和大小的一次性塑料容器中進(jìn)行培養(yǎng)。

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其中小的是96孔板,通常用于篩選應(yīng)用。

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另一方面,有一些細(xì)胞工廠被用于大規(guī)模生產(chǎn)疫苗或蛋白質(zhì)。

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與細(xì)胞培養(yǎng)物一起工作意味著在無菌條件下操作,例如在超凈工作臺(tái)上并使用抗生素。而且,必須向提供包含營養(yǎng)物和生長因子的適宜培養(yǎng)基,包括:葡萄糖、丙酮酸鈉、氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、水、由于其不穩(wěn)定性,因此經(jīng)常添加氨基酸谷氨酰胺。蛋白質(zhì),脂質(zhì)或生長因子通常添加在胎牛血清中補(bǔ)充。

 

細(xì)胞的代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)基酸化。因此,緩沖液系統(tǒng)可用于維持pH穩(wěn)定(?7.4)。通常通過酚紅指示劑監(jiān)測pH,并使用碳酸氫鹽(HCO3-)緩沖液,它們結(jié)合H+的能力取決于周圍的CO2水平。因此,通常向細(xì)胞培養(yǎng)箱提供CO2HEPES緩沖液獨(dú)立于CO2,通常用于無法進(jìn)行CO2孵育的活細(xì)胞顯微鏡應(yīng)用中。

 

顯微鏡

說到用于細(xì)胞培養(yǎng)的顯微鏡,其必須具備某些基本特征。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)就意味著顯微鏡必須具有倒置配置。在這種配置中,物鏡安裝在培養(yǎng)皿下方,培養(yǎng)皿放置在顯微鏡載物臺(tái)上,聚光鏡安裝在上方。只有通過這種設(shè)置,物鏡才能足夠接近樣品。此外,通過這種構(gòu)造,研究人員在樣品周圍具有更多的自由空間。

 

想要大致了解細(xì)胞培養(yǎng)的總體狀況,放大倍率為100x~200x足矣。哺乳動(dòng)物細(xì)胞固有的低對比度要求顯微鏡提供特定的對比度方法。相差和調(diào)制相差是常見的,而微分干涉(DIC)與通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的塑料容器不兼容。

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借助這種基本設(shè)備,研究人員可以判斷細(xì)胞數(shù)量和融合度。根據(jù)融合情況,將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至其他容器中。

 

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